circRNA：基于RNA-Seq数据的定量、差异表达分析及miRNA靶点预测

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简介：
本文介绍了利用RNA-Seq数据进行circRNA的定量与差异表达分析，并探讨了其潜在的miRNA结合位点，为研究circRNA的功能和机制提供了有力工具。 RNA-Seq数据中的circRNA定量、差异表达分析及miRNA目标预测的分析流程可以通过nf-core/circrna这一生物信息学管道实现。该管道专门用于从总RNA-Seq配对末端测序数据中，映射到人类Gencode参考基因组（GRCh37或GRCh38 v34）的数据中识别和量化circRNA，并进行差异表达分析及miRNA靶标预测。 nf-core/circrna以模块化方式设计，除了提供circRNA定量功能外，还允许用户选择性地执行miRNA靶标预测、差异表达分析（或者两者同时），以便更好地探索围绕circRNA在竞争内源性RNA网络中的作用机制。该管道使用了一种工作流工具构建，并且通过Docker容器进行部署和运行，这使得安装过程简单快捷，同时也保证了结果的高度可重复性。默认情况下，nf-core/circrna会启用所有三个分析模块：circRNA发现、miRNA靶标预测以及差异表达分析。

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circRNA：基于RNA-Seq数据的定量、差异表达分析及miRNA靶点预测

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本文介绍了利用RNA-Seq数据进行circRNA的定量与差异表达分析，并探讨了其潜在的miRNA结合位点，为研究circRNA的功能和机制提供了有力工具。 RNA-Seq数据中的circRNA定量、差异表达分析及miRNA目标预测的分析流程可以通过nf-core/circrna这一生物信息学管道实现。该管道专门用于从总RNA-Seq配对末端测序数据中，映射到人类Gencode参考基因组（GRCh37或GRCh38 v34）的数据中识别和量化circRNA，并进行差异表达分析及miRNA靶标预测。 nf-core/circrna以模块化方式设计，除了提供circRNA定量功能外，还允许用户选择性地执行miRNA靶标预测、差异表达分析（或者两者同时），以便更好地探索围绕circRNA在竞争内源性RNA网络中的作用机制。该管道使用了一种工作流工具构建，并且通过Docker容器进行部署和运行，这使得安装过程简单快捷，同时也保证了结果的高度可重复性。默认情况下，nf-core/circrna会启用所有三个分析模块：circRNA发现、miRNA靶标预测以及差异表达分析。

单细胞RNA测序数据的分析（scRNA-Seq）

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简介：单细胞RNA测序(scRNA-Seq)技术能够解析复杂组织中每个细胞的基因表达情况，为生物学研究提供前所未有的详细信息。本专题探讨了如何有效处理和解读这些海量且复杂的单细胞转录组数据，以揭示细胞异质性和发育轨迹等关键问题。为期2天的单细胞RNA-Seq分析课程将涵盖从scRNA-seq实验获取的数据计算分析方法。我们非常欢迎所有有助于改进本课程的贡献！如果您在过程中遇到任何疑问、疑虑或困难，维护人员会尽力提供帮助。请熟悉我们的规定，并了解如何以正确的格式呈现本地课程内容以及编写新章节的方法。您可以查看当前列表来获得为该存储库做出贡献的想法。为了进行您的贡献，我们使用GitHub流，在相关章节中对此有详细解释。本课程的当前维护者是 [此处应填写维护者的姓名或联系方式] ，如果您想引用此课程，请向他们咨询。作者可以在“找到参与者列表”部分查看参与本课程的人士名单。

ncPRO-seq：基于 sRNA-seq 的非编码 RNA 分析——开源

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ncPRO-seq是一款基于sRNA-seq数据进行非编码RNA分析的开源工具，旨在简化和增强对复杂转录组中非编码RNA的研究。 ncPRO-seq 是一种用于从 smallRNA 测序数据中注释和分析 ncRNA 的工具。它旨在对来自 miRBase、piRBase、Rfam 和 repeatMasker 中注释的非编码区域以及用户定义的区域的小 RNA 进行查询和详细分析。ncPRO 管道还有一个模块，用于识别明显富含短读长的区域，这些区域不能归类为已知的 ncRNA 家族。

RNA-seq数据的分析实用技巧（2015）

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本课程介绍RNA-seq数据分析的基本方法和实用技巧，涵盖2015年最新的技术进展与应用实例。适合生物信息学初学者及研究人员参考学习。 RNA-seq数据分析实用方法涵盖了该领域的各个方面。

RNA-seq、FPKM及Cuffdiff

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简介：RNA-seq是一种通过高通量测序技术分析转录组的方法；FPKM是衡量基因表达水平的标准指标；Cuffdiff用于比较不同样本间的差异表达。 RNA-seq是转录组测序技术，用于分析细胞内mRNA、非编码RNA等多种RNA的表达情况。该技术通过高通量测序手段获取并解析这些RNA的信息。 RNA-seq的主要步骤包括：首先分离出所需的RNA；然后将提取出来的RNA打断成小片段；接着进行反转录反应，即将RNA转化为DNA形式；最后采用类似DNA测序的方法对转化后的DNA序列进行测序分析。通过这样的流程可以得到不同基因在特定条件下的表达水平。为了获取每个基因的表达量信息，需要把从样本中获得的所有读段（reads）与参考基因组比对。如果某个基因对应的读段数量较多，则说明该基因在此条件下具有较高的表达丰度。

kallisto：近乎最优的RNA-Seq定量方法

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Kallisto是一款高效的RNA-Seq数据分析工具，用于定量转录本表达水平。它采用独特的伪 alignments 方法，在速度与准确性上达到近乎最优平衡，是生物信息学研究中的重要技术手段。卡利斯托（Kallisto）是一个程序，能够使用高通量测序读数从RNA-Seq数据或更广泛的靶序列进行转录本定量分析。它基于伪比对的新概念，可以快速确定读码与目标的兼容性而无需实际比对。在标准RNA-Seq数据基准测试中，Kallisto可以在Mac台式机上不到3分钟的时间内处理数千万个人类RNA-seq读取，并且仅需10分钟即可生成转录组索引。伪比对保留了定量所需的全部关键信息，因此不仅使Kallisto运行速度快，还使其在准确性方面与现有的其他工具相当甚至更优。事实上，由于伪比对程序对于读取中的错误具有较强的鲁棒性，在许多基准测试中，Kallisto的表现明显优于现有工具。 Kallisto的算法有详细描述发表于《自然生物技术》第34期的文章中。

RNA-DGE-Salmon-DESeq2：利用Salmon、tximport及DESeq2对FastQ文件进行差异表达分析

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本项目采用RNA-DGE-Salmon-DESeq2流程，通过Salmon量化转录本丰度，并借助tximport和DESeq2工具包从FastQ数据中开展差异表达分析。 RNA-seq技术是一种广泛用于研究基因表达变化的高通量测序方法，它能够提供大量关于转录本水平的信息。本教程将详细讲解如何利用Salmon、tximport和DESeq2这三个工具对FastQ文件进行差异表达分析。FastQ文件是RNA-seq实验后生成的原始数据，包含了测序得到的碱基序列。 Salmon是一款快速、准确的转录本定量工具，它使用基于准齐的量化方法，能够高效地处理大规模RNA-seq数据。Salmon通过索引参考转录组并采用精确的流式计算模型来估算每个样本中每个转录本的表达水平，这显著提高了速度和内存效率。在运行Salmon之前，需要准备一个参考转录组的索引以及每个样本的FastQ文件。接着，使用tximport将Salmon生成的估计量导入R环境中。tximport是一个R包，它允许将多个不同的转录本定量工具的结果整合到一个统一的数据结构中，便于后续分析。通过tximport，我们可以将Salmon的输出转换为DESeq2可接受的输入格式，包括基因ID、转录本长度和表达量等信息。 DESeq2是R中的一个流行包，专门用于RNA-seq数据的差异表达分析。它提供了统计建模和可视化工具，可以处理RNA-seq数据的生物学和技术变异。DESeq2的核心是基于负二项分布的模型，用于检测基因在不同条件下的表达差异。这个包还包括了大小因子的计算，以校正不同样本间的测序深度差异，以及多重测试校正，确保结果的可靠性。在运行DESeq2分析时，需要准备一个设计矩阵，描述实验的分组信息。例如，如果实验涉及两种条件且每个条件有三个重复，则设计矩阵会包括两列：一列表示样本编号；另一列表示对应的实验条件。DESeq2将根据这个矩阵进行方差分析，并找出在不同条件下显著差异表达的基因。整个流程通常包含以下步骤： 1. 预处理：构建参考转录组索引，质量控制FastQ文件。 2. Salmon量化：使用Salmon对每个样本的FastQ文件进行转录本水平的表达量估计。 3. 数据整合：利用tximport将Salmon输出转换为DESeq2可读格式。 4. 差异分析：在R环境中加载DESeq2，设定实验设计，并执行差异表达分析。 5. 结果过滤：根据调整后的p值和 fold change 进行筛选，找出显著差异基因。 6. 生物信息学富集分析：对差异基因进行GO富集分析、KEGG通路富集等，理解其生物学意义。 7. 可视化：利用如火山图、热图等图形展示差异基因的表达情况。此流程可能包括Snakemake工作流脚本和必要的配置文件。Snakemake是一个强大的生物信息学工作流管理系统，它使得复杂的分析过程自动化和可重复成为可能。通过解析这些规则可以了解每个步骤的具体执行细节，如命令行参数、输入输出文件等，并更好地理解和复现整个分析流程。 RNA-seq数据分析涉及多个工具和步骤的综合运用，从原始数据处理到最终生物学解释均需严谨对待。Salmon、tximport与DESeq2结合使用为RNA-seq差异表达分析提供了一条高效且可靠的道路。通过学习并实践此流程可以深入理解RNA-seq数据分析的核心内容。

TCGA RNA-seq数据ID转换

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本工具提供从基因组数据联盟（TCGA）获取的RNA测序（RNA-seq）数据中不同标识符之间的高效转换服务，助力研究人员深入分析肿瘤相关转录组信息。 TCGA（The Cancer Genome Atlas）是美国国家癌症研究所（NCI）与人类基因组研究所（NHGRI）共同发起的一项大规模项目，旨在通过基因组测序揭示不同类型癌症的遗传变异，并为癌症研究和治疗提供重要数据支持。在该项目中，RNA-seq技术对于理解基因表达水平、发现新型转录本及新基因以及深入解析癌症生物学过程至关重要。进行TCGA RNA-seq数据分析时，通常需要将基于ENSEMBL RNA ID的数据转换成更易读的gene symbol（基因符号）。这一过程中，可以利用多种生物信息学工具或数据库来实现ID转换。文中提到了几个关键资源：sangerbox在线ID转换器、R语言中的org.Hs.eg.db包以及人类基因命名委员会（HGNC）数据库。 Sangerbox ID转换器是一款便捷的在线工具，能够迅速将mRNA的ENSEMBL RNA ID转化为gene symbol。然而，它主要适用于mRNA数据，在处理非编码RNA如miRNA或lncRNA时效果可能不佳。 org.Hs.eg.db包是R语言中Bioconductor项目的一部分，包含大量人类基因注释信息，并可用于转换ENSEMBL RNA ID为gene symbol。不过文中提到使用此工具时常会遇到匹配不准确的情况，可能是由于数据库本身的信息局限性或操作不当所致。 HGNC数据库作为官方的人类基因命名和符号分配资源库，则提供了更为全面的基因相关信息，包括别名等额外信息。与org.Hs.eg.db包相比，在利用该数据库进行ID转换时可以得到更多且准确的结果：文中提到使用HGNC数据库能够成功转换36978个ENSEMBL ID，而使用org.Hs.eg.db包只能处理24125个。实际操作中，作者通过R语言代码实现了TCGA肝癌RNA-seq数据的ID转换。首先利用data.table包读取原始数据，并结合HGNC数据库和org.Hs.eg.db的数据进行一系列函数调用完成ID转换工作。在此过程中还特别强调了文件整理与合并的重要性。最终结果被输出至名为liver_FPKM.txt的新文件中，而文中提到的“黄色部分”可能指的是关键步骤或代码段落。作者采用韦恩图来直观展示并比较两种工具（HGNC和org.Hs.eg.db）在ID转换上的表现差异及其各自的优缺点。总的来说，在TCGA RNA-seq数据处理时需要根据具体需求选择合适的生物信息学资源，包括Sangerbox ID转换器、R语言中的org.Hs.eg.db包以及人类基因命名委员会（HGNC）数据库等工具来完成有效的ID转换工作。

RSCS：结合RNA-seq与小RNA-seq的策略

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RSCS是一种创新策略，它巧妙地融合了RNA-seq和小RNA-seq技术，为全面解析基因表达调控网络提供了强大工具。 RNA-seq和小RNA-seq是现代生物信息学中的两种重要高通量测序技术。RNA-seq主要用于全面分析细胞或组织的转录本表达水平，并揭示基因表达谱；而小RNA-seq则专注于研究长度为20-30个核苷酸的小分子非编码RNA，如miRNA、siRNA和piRNA等。在生物学研究中，这两种技术通常单独使用。然而，各自提供的信息有限。RSCS（即RNA-seq与小RNA-seq的组合策略）是一种创新方法，旨在通过整合这两类数据提高转录组注释的精度和深度。这一策略特别适用于哺乳动物样本的研究，因为它们具有复杂的基因组结构、多样化的转录本以及非编码RNA在调节生理过程中的重要作用。 RSCS计算流程通常包括以下步骤： 1. 数据预处理：使用工具如FastQC检查原始测序数据的质量，并通过Trimmomatic或Cutadapt去除低质量读段和接头序列。 2. 对齐：使用STAR、HISAT2 或 Tophat2 等对RNA-seq数据进行基因组对齐，小RNA-seq则通常用Bowtie2或miRDeep2与已知的小RNA数据库比对。 3. 转录本组装：对于RNA-seq数据，可以使用Cufflinks、StringTie 或 TransABySS等工具进行转录本的组装工作。 4. 定量分析：利用DESeq2、edgeR或Cuffdiff识别基因和转录本在不同条件下的表达差异。 5. 小RNA功能分析：通过miRDeep2、sRNAbench或TargetScan来鉴定小RNA的功能及预测其靶标基因。 6. 结合分析：将来自RNA-seq与小RNA-seq的数据整合，采用Bioconductor软件包或者自定义脚本发现新的剪接变异体、未注释的转录本以及非编码RNA的作用机制，并探究miRNAs和mRNAs之间的相互作用。 7. 功能富集分析：使用GOseq、DAVID或Enrichr等工具进行基因功能及通路富集分析，以解释所识别到的基因或者转录本的功能意义。通过编写Shell脚本来自动化这些步骤可以提高效率并确保一致性。RSCS策略能够为复杂哺乳动物转录组提供更全面和精确的信息解析能力，并有助于深入理解调控网络及其在疾病研究、药物靶点发现以及生物标志物鉴定中的应用价值。

R语言差异表达分析

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本课程详细讲解如何使用R语言进行基因差异表达分析，涵盖数据预处理、统计测试及结果可视化等步骤，适合生物信息学初学者。介绍使用R语言进行统计分析以识别差异表达的方法，内容来源于课程内部讲义，并注重实战操作。